mikrobiologi umum

BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Prosedur dalam Praktikum Mikrobiologi Umum

3.1.1 Pelaksanaan Praktikum Hari Pertama

3.1.1.1 Pengenceran Sampel

Pada praktikum pengenceran sampel, prosedurnya yaitu sosis ( sampel disesuaikan dengan kelompok ) dihaluskan dan ditimbang sebanyak 5 gram dengan menggunakan timbangan analitik. Setelah didapatkan sampel sebanyak 5 gram maka langkah selanjutnya yaitu sampel sosis dilarutkan dalam erlenmeyer yang telah berisi media pelarut pepton sebanyak 45 mililiter, lalu dihomogenkan dan didiamkan hingga mengendap. Tujuan dari pengendapan ini agar larutan sampel tidak menyumbat pada saat pemipetan. Larutan sampel dalam erlenmeyer dianggap sebagai pengenceran 10^-1. Setelah itu dilakukan transfer inokulan sebanyak 1 mililiter kedalam tabung reaksi yang telah berisi 9 mililiter pepton, dimana inokulannya berasal dari pengenceran 10^-1 sehingga dihasilkan pengenceran 10^-2. Dari pengenceran 10^-2 diinokulasikan 1 mililiter ke dalam tabung reaksi yang berisi pepton 9 mililiter sehingga menghasilkan pengenceran 10^-3, dan begitu juga seterusnya hingga dihasilkan tingkat pengenceran 10^-5.

3.1.1.2 Isolasi dan Pembiakan Mikroba

Pada praktikum isolasi dan pembiakan mikroba digunakan beberapa metode yaiitu pour plate, spread plate, dan streak plate, serta metode penanaman agar tegak dan agar miring.

Metode pour plate dilakuan dengan cara penambahan inokulan sebanyak 1 mililiter dari tingkat pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5 ke dalam 3 buah cawan petri. Setelah itu dituangkan media PCA ( Plate Count Agar ) sebanyak 10 – 15 mililiter atau kira – kira telah menutupi seluruh permukaan cawan petri ke dalam masing – masing 3 buah cawan petri yang telah berisi inokulan, lalu dilakukan penggoyangan menyerupai angka delapan ( 8 ) yang bertujuan agar media dan inokulan menjadi homogen, dan ditunggu hingga memadat.

Pada metode spread plate dilakukan dengan cara penuangan media PCA ( Plate Count Agar ) sebanyak 10 – 15 mililiter atau kira – kira telah menutupi seluruh permukaan cawan petri ke dalam 3 buah cawan petri dan ditunggu media dalam cawan memadat. Setelah itu diinokulasikan larutan sampel sebanyak 1 mililiter dengan menggunakan pipet volume yang berasal dari tingkaat pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5.

Pembiakan dengan metode streak plate dilakukan dengan cara penuangan media PCA ( Plate Count Agar ) sebanyak 10 – 15 mililiter atau kira – kira telah menutupi seluruh permukaan caawan petri kedalam sebuah cawan petri dan ditunggu media dalam cawan memadat. Setelah itu kawat ose dipijarkan menggunakan bunsen dan kawat ose tersebut dicelupkan kedalam larutan sampel dengan tingkat pengenceran 10^-1. Lalu kawat ose yang telah dicelupkan kedalam larutan media tersebut digoreskan secara spiral cawan yang telah berisi media yang telah memadat tersebut.

Selain ketiga metode tersebut juga digunakan metode agar tegak dan metode agar miring. Dimana yang digunakan dalam praktikum jumlah media agar tegak berjumlah 3 buah ( 1 buah agar tegak dengan media PCA, dan 2 buah agar tegak dengan media PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) ), dan jumlah media agar miring berjumlah 3 buah ( 1 buah agar miring dengan media PCA, dan 2 buah agar miring dengan media PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) ). Media PCA ( Plate Count Agar ) digunakan untuk media pertumbuhan bakteri dan media PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) digunakan untuk media pertumbuhan kapang dan khamir.

Prosedur penanaman bakteri dengan metode agar tegak yaitu kawat ose lurus dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel dengan pengenceran 10^-1. Setelah itu, kawat ose tersebut ditanamkan 2/3 bagian ke dalam tabung reaksi yang telah berisi PCA tegak. Sedangkan prosedur penanaman bakteri dengan metode agar miring yaitu kawat ose lengkung dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel dengan pengenceran 10^-1. Setelah itu, kawat ose tersebut digoreskan pada permukaan media PCA miring dengan bentuk goresan spiral

Prosedur penanaman kapang dengan metode agar tegak yaitu kawat ose lurus dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel tempe ( sumber biakan kapang ). Setelah itu, kawat ose tersebut ditanamkan 2/3 bagian ke dalam tabung reaksi yang telah berisi PCA tegak. Sedangkan prosedur penanaman kapang dengan metode agar miring yaitu kawat ose lengkung dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel tempe ( sumber biakan kapang ). Setelah itu, kawat ose tersebut digoreskan pada permukaan media PCA miring dengan bentuk goresan spiral

Sedangkan untuk prosedur penanaman khamir dengan menggunakan metode agar tegak yaitu kawat ose lurus dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel tomat ( sumber biakan khamir ). Setelah itu, kawat ose tersebut ditanamkan 2/3 bagian ke dalam tabung reaksi yang telah berisi PCA tegak. Sedangkan prosedur penanaman khamir dengan metode agar miring yaitu kawat ose lengkung dipijarkan di api bunsen lalu diambil atau dicelupkan ke dalam sampel tomat ( sumber biakan khamir ). Setelah itu, kawat ose tersebut digoreskan pada permukaan media PCA miring dengan bentuk goresan spiral.

Hal yang perlu diingat dalam isolasi dan pembiakan mikroba yaitu teknik aseptisnya seperti pemanasan pinggiran cawan petri sebelum dan sesudah penanaman mikroba dan juga pemanasan piggiran tabung reaksi yang berisi agar tegak dan agar miring sebelum dan sesudah penanaman.

Apabila telah dilakukan isolasi dan pembiakan mikroba pada cawan media dan agar tegak – agar miring yaitu dilakukan inkubasi pada inkubator dengan suhu 37 C selama + 24 jam. Perlu dicatat untuk media cawan sebelum diinkubasi dibungkus dengan kertas kraft.

3.1.2 Pelaksanaan Praktikum Hari Kedua

3.1.2.1 Perhitungan Koloni Bakteri pada Cawan Petri

Prosedur perhitungan koloni bakteri pada cawan petri yaitu cawan petri yang telah berisi media PCA dan inokulan bakteri yang menggunakan metode pour plate, spread plate, dan streak plate dikeluarkan dari inkubator setelah diinkubasi selama + 24 jam dengan suhu 37 C. Namun disini yang akan dihitung hanya cawan petri yang menggunakan metode pour plate dan spread plate. Sedangkan untuk metode streak plate tidak dilakukan penghitungan karena hanya dilakukan satu kali yaitu menggunakan sampel bakteri pada pengenceran 10^-1.

Proses perhitungan koloni bakteri dengan metode pour plate ( faktor pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5 ) dan spread plate (faktor pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5 ) yaitu menggunakan alat yang disebut colony counter, dimana prinsip kerja dari alat ini penempatan cawan petri yang berisi koloni bakteri ditempatkan di colony counter dan disentuh koloninya sehingga pada layar colony counter akan tertera jumlah koloni atau dengan kata lain sistem dari colony counter yaitu touch screen. Untuk mempermudah penghitungan digunakan kaca pembesar.

Dari hasil praktikum didaptkan hasil perhitungan koloni sebagaimana tertera pada tabel 1 di bawah ini :

METODE	JUMLAH KOLONI PENGENCERAN KE-			STANDART PLATE COUNT ( cfu/ gr atau cfu/ mililiter )
	10-3	10-4	10-5
POUR PLATE SPREAD PLATE STREAK PLATE	-	-	-
SAMPEL	SOSIS
RECORD	........... JAM

Tabel 1. Kuantitasi Mikroorganisme

3.1.2.2 Pembuatan Preparat Native

Dalam pembuatan preparat native alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, cover glas, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ), alkohol 95% dan aquades.

Proses pembuatan preparat native bakteri yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

Pada proses pembuatan preparat native kapang sistemnya sama yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni kapang pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

Sedangkan untuk proses pembuatan preparat native khamir yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni khamir tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni khamir tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

3.1.2.3 Pembuatan Preparat Ulas

Dalam pembuatan preparat ulas alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ), alkohol 95% dan metilen biru.

Proses pembuatan preparat ulas bakteri yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

Proses pembuatan preparat ulas kapang yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

Proses pembuatan preparat ulas khamir yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni khamir tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni khamir tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni khamir tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu...........................................................................................................................

3.1.3 Pelaksanaan Praktikum Hari Ketiga

3.1.3.1 Pewarnaan Gram

Dalam praktikum pewarnaan gram alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba pada cawan petri ( diambil pertumbuhan koloni yang paling baik ), metilen biru, iodine, alkohol 95%, dan safranin. Prinsip dari pewarnaan gram yaitu pewarnaan, pencucian, dan pembandingan.

Proses pelaksanaan pewarnaan gram pada saat praktikum yaitu pertama kawat ose dipijarkan di atas bunsen, lalu diambil koloni bakteri dari cawan PCA ( Plate Count Agar ) yang pertumbuhannya paling baik. Setelah itu, koloni yang telah diambil menggunakan kawat ose ditempatkan pada obyek glass. Pada saat penempatan koloni bakteri di objek glass tidak boleh terlalu tebal agar mudah untuk dipahami di bawah mikroskop. Setelah koloni di glass objek lalu langkah selanjutnya yaitu diteteskan metilen blue sebanyak satu tetes di atas koloni, didiamkan selama 1 menit lalu diguyur pakai akuades. Penambahan metilen blue di sini berfungsi sebagai pewarna utama pada sel bakteri yang memberi warna biru. Langkah selanjutnya yaitu penambahan iodine di atas koloni sampel dan didiamkan selama 1 menit lalu diguyur dengan akuades. Penambahan iodine ini berfungsi untuk memperkuat ikatan pewarna utama ( metilen blue ) dan membentuk komplek ikatan metilen blue++RNA. Setelah dilakukan penambahan iodine, tahapan selanjutnya yaitu penambahan 1 tetes alkohol 95% yang didiamkan 30 detik lalu diguyur dengan akuades. Tujuan dari penambahan alkohol ini agar lipid pada sel bakteri larut dan terjadinya dehidrasi protein. Langkah yang terakhir yaitu ditambahkan 1 tetes safranin dimana setelah penambahan safranin tersebut didiamkan 1 menit lalu diguyur dengan akuades dan dilakukan fiksasi. Penambahan safranin ini bertujuan sebagai pewarna pembanding. Setelah dilakukan fiksasi maka preparat bakteri gram dapat diamati di bawah mikroskop.

Dari hasil pengamatan diperoleh yaitu..............................................

3.1.3.2 Pembuatan Media

Pada pembuatan media agar cawan digunakan 3 metode yaitu metode pour plate, spread plate, dan streak plate yang kesemuanya berfungsi untuk isolasi dan pembiakan mikroba.

Nama media yang dibutuhkan antara lain PCA dan PDA serta media pelarut yaitu pepton. PCA ( Plate Count Agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri dengan takaran 17, 5 gram/ liter dengan ukuran yang digunakan untuk pembuatan media agar tegak sebanyak 10 mililiter dan untuk pembuatan media agar miring digunakan sebanyak 7 mililiter. PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan kapang dan khamir dengan takaran 39 gram / liter dengan ukuran yang digunakan untuk pembuatan media agar tegak sebanyak 10 mililiter dan untuk pembuatan media agar miring digunakan sebanyak 7 mililiter. Sedangkan untuk pelarut media pepton takaran yang digunakan yaitu 1 gram / liter, dimana yang digunakan dalam praktikum sebanyak 45 mililiter dalam erlenmeyer dan masing – masing 9 mililiter dalam 4 tabung reaksi.